我国苜蓿褐斑病研究进展
桂 枝1，高建明2，袁庆华3
苜蓿褐斑病（普通叶斑病）是由苜蓿假盘菌引起的一种世界性的病害，是我国各苜蓿产区，特别是西北地区最严重的病害之一，常造成牧草产量的较大损失，以及干草和种子品质的降低［1～3］。另外，家畜采食后会引起流产、不育等疾病［4，5］，对畜牧业有较大影响。目前，我国苜蓿种植规模迅速扩大，虽然采取了一些耕作栽培措施来减轻褐斑病所造成的损失，但效果并不明显。现在，全世界普遍认为抗病育种是最有前途的防治病害的方法，并积极向这个方向努力。鉴于苜蓿的重要经济价值，早在70至80年代，国外学者就开展了利用生物技术进行抗病性筛选以及改良苜蓿等方面的研究工作，以解决苜蓿生产中存在的问题［6］。在我国，由于种种原因，苜蓿生物技术的发展与国外相比还有差距，自从刘经芬与方中达于1956年报道了该病在南京的发生［7］后，国内的研究多集中于病情的田间调查与病原菌的鉴定方面［8～12］，只有少数学者通过田间调查对品种的抗性作了一些研究［2，13，14］。近年来，随着生物技术的发展，我国开始有人采用分子标记技术对褐斑病进行比较深入的研究［15～17］。本文将对国内的研究结果予以总结，并提出一些建议，以供我国有关的科技人员和生产者参考。
1 病原菌的生物学特性、引致的病害症状及病害发生规律
1.1 苜蓿假盘菌的生物学特性研究
苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌［Pseudopeziza medicaginis(Lib.)Sacc.］引起的一种最常见的世界性豆科牧草病害，这一点已经为人们接受［3，4，8，10，11］。对病原菌形态特征的描述也基本一致［4，12，16］：初期（约15 d），菌落呈不规则球形，黑褐色边缘色较浅，菌落表面出现白色绒状物，为未成熟子囊盘；生长后期（约30～40 d），菌落呈馒头状，高为直径的1/3～1/2，菌落正面为棕色或棕褐色，背面黑褐色，随后绒状物逐渐消失，出现许多呈棕色或棕褐色的小突起，即为成熟的子囊盘。子囊盘呈碟状，大小为370～640 μm，子囊呈棒状，无色透明，大小为(86～130) μm×(10～20) μm，子囊内有8个子囊孢子，子囊孢子为椭圆形的无色透明的单细胞，(15～20) μm×10 μm，该菌不产生分生孢子。仅在个别方面上存在差异，比如子囊孢子内是否含有油球，子囊间是否有侧丝［4］。
症状：该病主要发生于叶上，发病初期出现点状浅色褪绿斑，后逐渐扩大，多呈圆形；后期病斑上有褐色的盘状隆起物（子囊盘），子囊盘成熟后，病斑上出现一层白色蜡质，病斑大小一般为0.5～4 mm。感病严重的植株上病斑密布整个叶片，导致叶片变黄、皱缩，并提前凋萎、脱落［16］。
1.2 苜蓿假盘菌的培养
在假盘菌的人工培养方面，普遍认为此菌不适宜进行液体培养，但在假盘菌的最佳培养方面存在2种差异较大的方法。一种认为：假盘菌在新鲜的琼脂培养基上生长欠佳，最好是以2%的燕麦粉琼脂培养基（制成后放置数日）培养才可以形成大量子实体［4］。但是袁庆华的研究则表明［16］：假盘菌的寄生性较强，人工分离培养难度很大，利用组织块分离法无法获得病原菌。利用离心稀释分离法，并在V8碳酸钙琼脂培养基和燕麦片培养基上培养方可获得纯菌株。但苜蓿假盘菌在不同培养基上菌落大小、菌落产生的数量及菌落形态特点存在明显差异：在PDA培养基上不能形成成熟的子囊盘；在燕麦片和苜蓿汁液培养基上菌落形成较慢，且容易污染；而在V-8碳酸钙琼脂培养基上生长良好，病菌经20 d培养，逐渐形成成熟的子囊盘。在V-8碳酸钙琼脂培养基上，适宜子囊孢子萌发和菌落生长的pH为3～8和4～6（最适pH为5）。在人工培养基上病菌生长缓慢，生长40 d的菌落直径只有2.5～3.5 mm，经过20 d才能形成成熟的子囊盘。苜蓿假盘菌子囊孢子萌发温度为6～25 ℃，最适温度为15～20 ℃。芽管生长温度为10～30 ℃，最适温度为20 ℃。不同菌株间致病力存在显著差异。
1.3 苜蓿褐斑病的分布及危害
自1956年刘经芬与方中达首次报道了该病在南京的发生后，随着研究工作的不断深入，目前该病在我国新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、吉林、河北、山西、山东、湖北、江苏、云南等省（区）均有报道［8］，但实际上此病可能遍布国内所有苜蓿种植地区［4］，是我国苜蓿生产中最为常见及危害性较大的病害之一。1959年仇元描述了该病在陕西武功的表现［18］。陈申宽对内蒙古扎兰屯市苜蓿褐斑病的田间调查研究结果表明，发病严重的苜蓿植株下部1/3处叶片全部脱落，病株较健株叶片重量下降12.5%［19］。南志标在新疆阿勒泰地区的研究表明，褐斑病在种子田的发病率达100%［8］。在甘肃省海拔2 400 m的中部山区和海拔3 000 m的祁连山地，苜蓿褐斑病发生严重，落叶率达50%以上，病重时牧草减少15%～40%，种子减产 25%～57%，粗蛋白质含量下降16%，可消化率下降14%左右［20］。据苏生昌报道，苜蓿褐斑病在新疆北部的病叶率为54.7%～100%，病指数在16.8%～ 90.1%，发病严重时，叶片的病斑数多达百余个，叶片褪绿、黄化并提前脱落［9］。时永杰（1998）报道，褐斑病在甘肃省各地都有发生，一般6月中旬开始发病，随着气温上升、降雨增多，发病日趋严重；后期时，病株叶片大量脱落，严重影响苜蓿的产量和品质［10］。朱伟等在1998年采用定点定期采样、调查、测定的方法，研究了紫花苜蓿褐斑病的发生危害程度及发病条件，结果表明呼伦贝尔草原苜蓿褐斑病的发病日期与病情指数间呈显著正相关［12］。袁庆华1999年对吉林省农科院牧草实验地调查时发现，公农2号苜蓿褐斑病发病率在30%以上，落叶率达10.5%～25%；对北京及周边地区进行田间调查时发现，重病地苜蓿褐斑病发病率可达80%以上，落叶率达60%以上，减产40%～60%［12］。南志标、李春杰等的研究表明：褐斑病使苜蓿病叶中粗蛋白含量显著下降，与健叶相比，其含量可减少25%，减少的幅度与病害严重度呈极显著负相关。叶片光合速率随病害严重度的增加而降低，当病斑平均面积为叶面积的13%时，光合速率仅为健叶的52%，而当病斑平均面积为叶面积的85%时，其光合速率仅为健叶的15.9%。在参试的94个品种或群体中，83个品种均表现出较高的感病性［20］。
1.4 苜蓿褐斑病的发生规律
苜蓿假盘菌子囊孢子萌发的温度范围为2～30 ℃，以10～20 ℃最为适宜，高于30 ℃时萌发率很低，它在24～36 h内萌发并侵入寄主后，经过20～25 d的生长发育才能形成成熟的子囊盘；苜蓿假盘菌在田间最适侵染温度为10～20 ℃，25～28 ℃时侵染减退，28 ℃以上停止侵染。因为子囊盘必须在液态水中16～20 h或是维持97%～99%的相对湿度24 h以上，子囊孢子才可以连续放射，且孢子的萌发和侵入也需要持续保持3～4 d高湿（79%～97%的相对湿度）才能完成，所以该菌在田间最适宜的环境条件是温暖而潮湿的天气。当相对湿度达58%～75%时，日均温在15～30 ℃，旬均温为10.2～15.2 ℃，褐斑病开始流行，当温度达16～17 ℃，相对湿度为79%～97%时，几天之内就造成病害流行。降水结露促进此病发生。该菌以子实体在田间或种子间的病残体上越冬，也可以夹杂在残体上越冬。翌年，当环境条件适合时，子囊孢子充分发育后作为初侵染源侵入寄主。每一子囊盘在成熟后条件适宜时，需8～15 d才能将子囊孢子基本释放完毕，因而可以多次发生再侵染。大量灌水使病情严重，宽行播种时发病较轻。此病主要在生长季中后期严重，对第二、三茬苜蓿危害较大［4,10,16］。
2 抗褐斑病苜蓿材料的鉴定和筛选
近年来，人们公认采用抗病品种是防治褐斑病的最有效措施，抗病育种是最有前途，也是最根本的病害防治方法，并且在世界范围内受到越来越多的重视［21］。抗病育种的关键性一步就是抗病材料的鉴定和筛选。例如美国科学家通过活体叶和茎的接种技术，从Delta品种中筛选出了第一个抗三叶草核盘菌的苜蓿种质材料MSR［22］。尽管我国的苜蓿地方品种、引进品种及育成品种数量不少，种质资源丰富，但国内近10多年来对有关抗病性鉴定方法、苜蓿品种资源抗性表现的评价、环境条件对苜蓿品种抗性表现的影响等研究工作尚属空白。因此，在我国开展苜蓿抗病性筛选具有重要意义。其中，鉴定和评价苜蓿对褐斑病的抗病性则是培育和利用抗病品种防治苜蓿褐斑病的基础。
侯天爵［2］和陈申宽［14］等在田间自然感病条件下分别对苜蓿的60个品种和12个品种进行抗性评价，认为不同品种间抗性存在较大差异，评价中发现有些抗性不够稳定，猜测可能是受不同年份气候条件或者是受病害分级标准、取样时间和次数的影响造成的。刘若［6］则在病害调查中注意到在不同品种间抗病性存在差异。南志标等［21］研究并评价了在田间自然发病条件下85个紫花苜蓿、5个杂花苜蓿（M.varia）和4个黄花苜蓿（M.falcata）品种或群体对褐斑病的抗性。结果发现：在参试的94个品种或群体中，仅润布勒杂花苜蓿的一个群体表现为免疫。抗病性较强的有来自加拿大的巴瑞尔、阿毕卡，来自美国的威斯康星和我国的兴平、武功、肇东等10个紫花苜蓿品种和润布勒杂花苜蓿的另一个群体。其余83个品种均表现出较高的感病性，其中包括美国的78-15，加拿大的大西洋，我国的和田、咸阳等紫花苜蓿品种和内蒙黄花等黄花苜蓿品种。袁庆华则首先研究和鉴定了苜蓿褐斑病抗病性的离体叶接种技术［17］。试验结果不仅表明离体叶接种鉴定比传统的整株鉴定效率高、结果可靠，而且说明采用孢子弹射法对离体叶片进行接种是较为成功的方法，而用孢子悬浮液接种，直到叶片变黄仍未出现感病症状。接种所需的适宜条件是：相对湿度接近100%，温度20 ℃，接种时间20 h，无光照。培养所需的适宜条件是，生长箱内光照（光强度9 000 lx）和黑暗每12 h交替一次，有光时22 ℃，无光时18 ℃。在0.3%水琼脂培养基中加入50 mL/L苯骈咪唑后，可达到最佳保绿效果。此外，袁庆华在实验室条件下还对国内外收集的250份苜蓿种质材料幼苗就褐斑病的抗性进行了筛选［15］。结果同样证明在被测定的250份苜蓿种质材料中抗病性存在很大差异。在室温条件下均感染苜蓿褐斑病，幼苗发病率在11.1%～100%之间，叶片病指数在4.1%～73%之间；高抗材料占18%，中抗材料占45.2%，中感材料占32.8%，高感材料占4%；有45份（占总数18%）的病指数低于20%，全部为国外品种，它们均可作为抗病材料；病指数大于60%的10份最敏感的材料中有6份来自国内，4份来自国外。桂枝等［23］又对其中的5个品种（病指数在 13.48%～33.68%）做了进一步的研究。从每个品种的600株苗中用离体叶片接种，每一单株均经过4次接种选择，分别从每个品种中选出10株最抗和10株最感的单株，运用RAPD技术，采用集群分离分析法，对5个苜蓿品种进行抗褐斑病基因连锁的分子标记研究。结果表明：在所筛选的160个10碱基随机引物中，107个引物有扩增产物，对54个引物扩增出的产物进行电泳，图谱较稳定、清晰，筛选出8个能同时在3个以上苜蓿品种内抗、感材料间显示多态性的随机引物，RAPD标记的大小为600～1 400 bp。同时对苜蓿褐斑病抗、感材料中的3种同工酶（PPO、POD、SOD）的活性及电泳测定表明，抗性材料比感病材料酶活性高，酶带更丰富。
上述资料说明目前我国在苜蓿抗褐斑病品种的选育上存在下列不足：由于田间调查受时间、地点、生态条件及品种数量的限制，具有很大的不确定性，难以进行有效的抗病性筛选，所以极有可能使优良种质材料被埋没；在用传统的碎菌丝体、孢子喷洒全株或茎尖接种以及田间自然传染等方法评价苜蓿的抗病性时，结果常会受到时间、地点、规模、发病条件和接种均匀度等因素的限制，很难达到令人满意的结果；利用离体叶片接种技术进行抗病性鉴定，具有其它整株接种方法无法比拟的优越性和可靠性，在时间、规模及效率上均突破了以往筛选方法的局限性，为抗性种质资源的批量筛选提供了有效方法，不仅降低了误选的可能性，同时克服了活体整株接种的植株不能反复多次、大批量筛选的局限性。
3 综合治理
苜蓿褐斑病是苜蓿叶部病害中一种重要的病害，病菌可在苜蓿的根茎内或病株残体上越冬，在田间主要是靠气流、风和雨水传播病菌，并能反复多次侵染，是造成病害大流行的主要原因。目前，随着“退耕还林”等一系列政策的施行，我国苜蓿种植规模迅速扩大，因此必须采取综合防治的各种措施，以便更有效地防治苜蓿褐斑病。
首先，控制该病最基本的措施是切断侵染源。一是在苜蓿越冬前或返青后清除枯枝落叶及田间杂草，减少次年春天初侵染菌源；二要认真进行种子的去杂清洁工作。其次，是采用一些耕作栽培措施，如与禾本科草混播可显著降低发病率，收种地应宽行播种，种植过程中减少灌水次数［4］。第三，当草地已经普遍发病后，尽可能及时刈牧利用，以减少下茬草的发病程度，重病草地再不宜收种［4］。
但是不可否认，目前我国虽然采取了一些耕作栽培措施来减轻褐斑病所造成的损失，但效果并不明显。关键的原因就在于抗褐斑病的苜蓿品种极其缺乏，只有培育出抗病品种，才可能从根本上解决这一问题。在美国，育种家已从大多数常见的对褐斑病只有中等抗性的苜蓿栽培品系中选育出一些高抗品系，并结合提前收割、去掉保护行中的早发病株等耕作栽培措施，取得较好的抗褐斑病效果［17］ 。国内外的研究均发现，不同品种的苜蓿群体间存在着对褐斑病抗性的差异，采用轮回选择，可提高品种的抗病性，并减少起香豆醇类物质的含量［22］。国内一些学者认为，润布勒品种不同群体间抗病性的巨大差异为抗病品种提供了可能［2，13，14，20］，也有人采用分子标记技术对抗病的苜蓿种质材料进行研究［23］，但与国外相比差距仍然较大，今后应特别重视这方面的研究，选育出我国自己的抗褐斑病品种。
重视苜蓿品种抗褐斑病机理的研究，为抗病品种选育提供依据。目前我国苜蓿主要病害的研究大多集中在病原的田间调查和品种抗性评价上，而在苜蓿主要病害的抗性机制方面，未进行系统的研究。今后要有重点地开展这方面的工作，明确与抗性密切相关的关键性化学物质及其作用方式。
重视对苜蓿收获后储存阶段病害的研究。随着苜蓿产业化的发展，在牧草收获后的储藏过程中，草产品受多种腐生菌的侵害，不仅降低苜蓿品质，而且真菌孢子可引起家畜和饲养人员的呼吸道疾病［24］，这一点已经引起国外研究者的重视，而我国对苜蓿收获后真菌病害的防治研究（尤其是抗真菌种质资源研究）尚属空白，今后应重点加强这方面的研究工作。
